زهرا بختیاری

1- کشتن رتها و جدا کردن استخوان فمور (گاها هومروس و تیبیا): روشن کردن هود و الکل کشی(زیر هود و ست جراحی و...) - عدم باز شدن روده ها - سرعت عمل - عدم شکستگی استخوان - پاک کردن با تامپون(جلوگیری از آلودگی) - قرار دادن در پتریدیش حاوی محیط کشت سانتریفیوژ: فالکون حاوی مغز استخوان را با دور g 1500 به مدت 5-10 دقیقه سانترفیوژ می نماییم. پس از سانترفیوژ محیط رویی را تخلیه و به سلولهای ته نشین شده حدود یک سی سی لایزینگ بافر اضافه می کنیم و بلافاصله به محیط مملو از یخ یا فریزر به مدت 5 دقیقه منتقل می کنیم. پس از آن به مقدار 3 سی سی از محیط کشت به محتویات فالکون اضافه می کنیم (یعنی 3 برابر حجم لایزینگ بافر بکاررفته) تا لایزینگ بافر را خنثی نماییم دوباره با سرعت 1500 و به مدت 5- 10 دقیقه سانترفیوژ می نماییم. باید لایزینگ بافر ایجاد یک لایه سفید در سطح سلولها نماید که نشاندهنده رسوب گلبولهای قرمز است در غیر اینصورت دوباره لایزینگ بافر را اضافه می کنیم وتکرار می شود. سپس محیط رویی را تخلیه و سلولهای ته نشین شده را به فلاسک (دارای لیبل و تاریخ) اضافه می کنیم محتویات فلاسک T75 برای کشت ماست سلها: محیط کشت RPMI 15 سی سی ساپلمنت 1/5 سی سی FBS 2-3 سی سی (حدود 10-20 % کل محیط 25 سی سی) PW (پاکوویت) حدود 5-7 سی سی در انتها فلاسک را به انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با CO2 5% برای مدت 5-7 روز منتقل می کنیم. بعد از سپری شدن 5-7 روز از تهیه کشت ماست سل، فلاسک تعویض می شود و از فلاسک جدید استفاده می شود به دلیل چسبندگی بعضی از سلولهای بنیادی. نکته 4- رنگ محیط مشخص کننده زمان تعویض است که اگر محیط صورتی یا پوست پیازی اولیه به رنگ روشن و متمایل به زرد گرایید بهتر است محیط تعویض شود هر چند هنوز زمان آن سپری نشده باشد. تعویض محیط کشت: بعد از گذشت 5-7 روز محتویات فلاسک را داخل یک فالکون تخلیه می کنیم فالکون را با دور 1200-1500 به مدت 5-10 دقیقه سانترفیوژ می نماییم محیط رویی را دور میریزیم می توانیم سلولها را شمارش کنیم وبعد به داخل فلاسک حاوی محیط اضافه می کنیم. نکته: تغییر رنگ محیط کشت از قرمز به زرد نشاندهنده ی نیاز سلولها به تعویض محیط و دریافت مواد مغذی برای رشد می باشد. نکته- تنها بعد از تعویض محیط اول فلاسک را تعویض می کنیم و از فلاسک جدید استفاده می نماییم در سایر زمانهایی که تعویض محیط سلولی را داریم از همان فلاسک اولیه استفاده می کنیم(روز 19-21 زمان بلوغ ماست سلها)